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    OpenSPR快速測定α-乳清蛋白濃度方法詳解
    點擊次數:877 發布日期:2018-9-6  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負

    什么是濃度分析? 

     

    一般在濃度分析中,需加入不同濃度的目標分析物做測定,并根據測量的結果對每個樣本的濃度創建一個標準曲線。隨著分析物濃度的增加,與固定的結合配偶體的結合速率也增加。然后通過標準曲線確定未知的樣品中分析物的濃度。

     

    為什么我們要測量蛋白濃度?

     

    蛋白對研究很重要,因為它們構成了植物和動物細胞功能的基礎。而且,還需要蛋白濃度分析來確定蛋白的質量、數量以及生物反應的狀態。此外,在通過色譜、電泳和免疫化學技術處理蛋白樣品進行提取,分離和分析之前,確定蛋白濃度是必要的。在實驗過程中,需要根據蛋白質量要求和你實驗中所需蛋白純度和蛋白量而選擇不同的蛋白測定方法。選擇合適的方法測定樣本蛋白將影響到你研究的整體成功。因此蛋白濃度測定及方法的選擇至關重要。

     

     

    OpenSPR如何快速測定α-乳清蛋白濃度 ?

     

    如何快速,簡單且低成本的測定蛋白濃度呢?

    OpenSPR可以幫助你。

    接下來我們就來給大家展示如何用OpenSPR快速測定牛奶中的一個重要蛋白α-乳清蛋白的含量。

     

    α-乳清蛋白是存在于所有哺乳動物乳汁中的14kDa蛋白質,它是人乳中第二豐富的乳清蛋白;由于其高營養價值,經常被添加到嬰兒配方奶粉中。因此,需要濃度測定,以確定嬰兒配方食品中的補充含量,及牛奶中的天然含量和牛奶蛋白中的乳蛋白分離物的含量。

     

    與ELISA等技術相比,SPR提供了一種簡單,快速且經濟的平臺,因為它不需要標記,可以實時獲得結果,并且相同的傳感器表面可用于許多樣品的檢測即芯片可重復利用。因此我們開發了一種使用OpenSPR測量α-乳清蛋白濃度的方法。該測量法能夠測量15ng/ml至1000ng/ml的蛋白濃度,具有極佳的重復性。該測定可在5分鐘內提供未知樣品的結果,并可使用OpenSPR-XT完全自動化,為傳統ELISA方法提供了極好的替代方法。

     

    實驗步驟

     

    1.  將抗-α-乳清蛋白IgG稀釋到200µg/ml,加入到PH5.5的醋酸鈉中;

    2. 在激活后的芯片表面注入α-乳清蛋白,以20ul/min固定5min;

    3. 將要分析的α-乳清蛋白分別稀釋至3000,2000,1000,750,500,300,200,100,50,10和1ng/ml;

    4. 每種濃度結合時間3min,解離時間6min,不同濃度之間用glycine-HCl再生注射;

     

    Binding of α-lactalbumin to anti- α-lactalbumin at concentrations of 3000, 2000, 1000, 750, 500, 300, 200, 100, 50, 10, and 1 ng/ml.

     

    數據分析

     

    將α-乳清蛋白IgG固定后,用乙醇胺封閉表面后,用glycine-HCl再生,重復兩次注入3000 ng/ml α-乳清蛋白測試條件后,再將 11種不同濃度的α-乳清蛋白分別注入,每次注入之間通過HCL 再生。實驗完成后,將數據導入TraceDrawer™并使用affinity/EC50模塊進行分析,以確定反應方程:

    Y = Rmax*c/(c+KD) + offset

     Y 為SPR 反應, Rmax 為飽和信號值, c 為分析物濃度 ,KD為親和力常數。使用非線性回歸。下面的等式確定了檢測情況: KD: 8.47nM;Rmax: 37.2;pm Offset: 3.65 pm ;Y= 37.2*c/(c+8.47nM) + 3.65

     

    軟件擬合的所有常數獲得極低的誤差以及低的1.55卡方值。輸入樣品的SPR信號為“Y”并求解濃度即可確定未知濃度的α-乳清蛋白濃度 。本次實驗測定的動態范圍是15ng/ml-1000ng/ml,儀器的理論檢測限為3ng/ml。這些參數可通過優化可進一步改進或提高,以適應不同的檢測需要。相同濃度重復的CV值約為6% ,比較良好。該測定方法的性能足以滿足工業應用,并且與Biacore結果媲美。

     

    Affinity analysis of α-lactalbumin binding assay

     

    OpenSPR測定蛋白濃度優勢

     

    表面等離子體共振(SPR)是可以用于確定生物分子活性濃度的一種非常精確的方法,其基于與特異性結合配體的高親和力相互作用測定,從而可以進行速率的檢測和終點測定。目前,研究人員用了很多不同的方法測定蛋白濃度,包括UV光譜,Bradford,Lowry方法和BCA(Bicinchoninic Acid)。每種方法都有不同的優點和缺點。

     

    比如The Lowry, BCA and Bradford測定法是測量溶液中蛋白的總濃度。相比之下,ELISA和SPR可以測量溶液中特定蛋白的濃度,因此研究人員可測定測量復雜的溶液中特定蛋白的濃度。然而,由于ELISA是終點分析,因此在分析中涉及到的步驟較多,與SPR相比,其很難定位出現錯誤的環節。此外,由于消耗大量的抗體和需要標記,以及需要多次洗滌和孵育步驟,ELISA更耗時且成本更昂貴,因此這些方法都不是蛋白濃度測定方法的最佳選擇。

     

    OpenSPR采用的基于納米金顆粒的創新LSPR檢測技術,在蛋白濃度的測定應用中是一種操作簡單、快速且經濟有效的濃度分析方法,此外SPR還可以用于許多其他目的研究。它是一種無標記技術,可以讓研究人員實時定量分析兩種生物分子間的結合動力學。SPR技術可以幫您確定相互作用的 kon, koff 和KD值,與只提供終點測量的其他技術相比,可以更深入的了解分子間的結合作用情況。

     

     

    Nicoya OpenSPR分子相互作用儀的優勢

    • 操作簡單---1小時即可掌控

    • 完整動力學參數檢測---Ka,Kd,KD

    • 高效率---一鍵式分析,10min出結果,1-2h獲完整動力學結果

    • 高精準---檢測不受溫度、緩沖液折射率影響  

    • 無需專用校正通道---可忽略的bulk效應

    來源:普瑞麥迪(北京)實驗室技術有限公司
    聯系電話:4006-813-863
    E-mail:[email protected]

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